fantom_zona’s diary

合成生物学(と最近では神経変性疾患)

びまん性正中グリオーマに対するCAR-T療法

この記事は、今年読んだ一番好きな論文2018の12月15日の記事です。
adventar.org

この一年は色々面白い話を見聞きしたのですが、いざ一番面白いのを選んで紹介するとなると、色々それぞれの良さがあるわけで選定するのって難しいですね*1。そういうわけで、色々悩んだ挙句、Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M+ diffuse midline gliomasを紹介しようと思います。Bench-to-Bedside感あるやつで僕はCAR-T好きなので選定しました。

15秒で終わる紹介

・H3-K27M変異*2のびまん性正中グリオーマではGD2が高発現していることを発見した。
・GD2に対するCAR-T細胞を作成した。
・同所性に腫瘍細胞を移植されたマウスに抗GD2 CAR-T細胞を投与したところ、腫瘍細胞が除去された。
・一部マウスでは抗腫瘍効果による炎症反応で水頭症*3を発症し、致死的であった。

導入

まず、「キメラ抗原受容体T細胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T細胞)」というワードと「びまん性正中グリオーマ(diffusive midline glioma, DMG)」というワードから説明したいと思います。

近年、B細胞性の急性リンパ球性白血病(B-ALL)に対する抗CD19 CAR-T細胞を始めとして、クローナル?*4な病変に対するChimeric antigen receptor T cell(CAR-T細胞)の有効性が注目されてきています。少し前にノバルティスからキムリアが出されて話題になっていたことを記憶している人もいるでしょう。CAR-T細胞のコンセプトは、細胞外領域に単鎖抗体、細胞内ドメインにCD3ζをくっ付けた受容体をT細胞に発現させることで、任意の細胞外抗原依存的にT細胞を活性化させるというものです。したがって、腫瘍細胞特異的な膜タンパクに対する人工受容体を作成・導入すれば、腫瘍細胞に対する炎症反応が惹起され、腫瘍細胞は除去されるだろうというのがCAR-T療法です*5

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CAR-T細胞のコンセプト概略図
https://www.amed.go.jp/news/release_20171107.html より拝借)

分子標的薬など治療法の発展によって様々な腫瘍の生存期間が延長している一方、DMGという腫瘍ではそうではありません。こちらのページ*6を参照して、論文紹介に必要な項目だけ抜き出すと、DMGは、
・橋を中心とした脳幹部にびまん性に発生する小児腫瘍
・現時点の有効な治療法は、緩和的な放射線照射のみ
・予後は極めて不良
という腫瘍です。DMGは橋に発生することが多く、この場合、びまん性内在性橋グリオーマ(DIPG)という名前が付いています。橋には生命維持に重要な中枢が多く存在するために、切除することはできません。DMGは小児脳腫瘍の10%を占めているにも関わらず、DMGに対する治療法はほとんど進歩していないため、長期生存が見込める様な革新的な治療法が長らく求められています。

以上を踏まえて、DMGに対するCAR-T細胞を作成すれば新たな治療戦略になるのでは?という疑問に対する研究を今回紹介します。

結果

びまん性内在性橋グリオーマではGD2が高発現している

著者たちは、まず、DIPGの検体を用いて抗原を探しました。抗体のライブラリを用いて抗原になりそうな表面抗原を同定したところ、GD2が複数の検体に共通して最も高発現でした。GD2はdisialogangliosideというガングリオシドの仲間だそうです

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GD2はDIPGのマーカー候補である
また、免疫染色でもH3-K27M陽性の細胞にGD2が発現していること、H3-K27M陰性DIPG(VUMC-DIPG10)や高分化型グリオーマ(SU-pcGBM2)ではGD2の発現が弱いことが確認できました。
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免疫染色・フローサイトメトリによるGD2発現の確認

抗GD2 CAR-T細胞は、DIPGに対してGD2依存的に細胞障害性を示す

GD2が良い候補であったため、次にこれに対するCAR-T細胞がワークするのかを検討しました。作成したCAR-T細胞は、vitroでGD2陽性DIPGを除去することが分かりました。また、GD2依存的な活性化であることを、GD2陽性/陰性含む複数の検体やGD2合成酵素をノックアウトした細胞を作成して確認しています。人工受容体のネガティブコントロールとして抗CD19に対するCARを使用しています。

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in vitroで、抗GD2 CAR-T細胞はGD2特異的に細胞障害を引き起こす
GD2は当然正常組織にも発現しているため、正常組織に対しても細胞障害性を引き起こすように思われます。今回の人工受容体と同様のデザインによる抗GD2 CAR-T療法は他の疾患で先行研究があり、ヒトでの臨床研究が行われていますが、大きな神経毒性を持つことは報告されておらず、ヒトにおける安全性はある程度担保されていると考えられるようです。

CAR-T細胞は、DIPG同所性移植マウスで抗腫瘍効果を発揮する

次にin vivoでCAR-T細胞の効果を検証するため、ルシフェラーゼを発現させたDIPGを橋に移植したモデルマウスを作成しました(ちなみに、移植してもきちんとびまん性に浸潤する)。移植後7-8週間の後にCAR-T細胞を静注、静注後40日まで(40 DPT, 40 days post-treatment)追跡を行いました。すると、ルシフェラーゼの発光が時間とともに減少していき、実際にDPT50ではH3-K27M陽性細胞が組織はほとんど認められなくなりました。

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抗GD2 CAR-T細胞投与マウスではルシフェラーゼの発光が減少する

実際の組織はこちら。(腫瘍はGFPを発現している)

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組織像でも、抗GD2 CAR-T細胞投与マウスでは腫瘍が除去されている

CAR-T細胞は、DIPG同所性移植マウスの生存期間を延長する

最も重要な問いは、「実際にCAR-T細胞はマウスを救うのか?」というものですが、そのためにはモデルマウスが死んでくれないと困るわけです。ですが、先ほどのモデルマウスではDPT50を生きながらえてしまうようなので、著者たちは、腫瘍の増生が激しいタイプの患者由来細胞(SU-DIPG13P)を移植して、ひと月ほどで死ぬモデルマウスを作成し、これを用いて生存期間の解析を行いました。すると、CAR-T細胞によって腫瘍が除去され、生存率の改善を認めることができました。

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生存解析のための短命モデルマウスの作成

しかし、CAR-T細胞によって治療したにも関わらず、死んでしまったマウスも存在します。このマウスの組織をみたところ、水頭症を示唆するような脳室の拡大が認められていました。移植部位以外での非特異的な脳実質の炎症などは認められませんでした。

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抗GD2 CAR-T療法による水頭症の発症

CAR-T細胞は、他のタイプのDMG同所性移植マウスの生存期間も延長するか?

これまでは、DMGの中でも橋に発生するDIPGという腫瘍について検討してきましたが、同様の知見がDIPG以外でも成立するのかを最後に検討しました。
以下駆け足になりますが、視床と脊髄に発生したDMGでもGD2が発現していることを確認し、それぞれ同所性に移植しその後にCAR-Tを投与して反応をみました。

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その他DMGでのGD2発現確認
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視床DMGに対するCAR-T療法は、腫瘍を除去するものの生存率を悪くする
脊髄の場合はDIPGのように上手く行ったのですが(略)、視床の場合、きちんと腫瘍が除去されているにも関わらず、マウスの生存率は下がってしまいました(図のk)。これは、炎症による腫瘍の腫脹によって*7、脳が押しやられ逸脱する現象(テント切痕ヘルニア)によって死亡するためのようです(図のj)。腫瘍の炎症による腫脹はDIPGの場合でも認められ、それは水頭症として現れましたが、視床は特にテント切痕ヘルニアが起こりやすい位置に存在するため、腫瘍よりも脳ヘルニアで死亡する割合が増えてしまうようです。モデルは免疫不全マウスに腫瘍を移植して作成したため、実際に移植した際の炎症反応よりも抑えられている可能性があると著者らは論文内で考察しています。

まとめ

GD2に対するCAR-T療法は、DMGを除去することが分かりました。しかしながら、橋では水頭症視床ではテント切痕ヘルニアによって死亡例が出てきてしまいました。

感想とか、自由記載欄的な

DIPGというとmiserableな予後の腫瘍という印象がすごく強かったんですが、論文を読む限り割と希望が持てそうな感じだったので感動しました。サイエンスとしての面白さという点ではもっと面白いことしてるのは沢山あったんですが、実際に医療にインパクトを及ぼしそうな印象を受けたので今回紹介しました。
水頭症・脳浮腫対策とか取ったらどれだけ生き残れたんですかね。考察では、シャント作ったり減圧すると良いんじゃないかと書いてありましたが、気になるところなので早く続報が出てきてほしいです。

*1:あと、他の日本語メディアで紹介されてるのを避けてくと割と減ってしまう。仕方ないけど。

*2:この変異が多く8割ほどで見られる

*3:脳に髄液が貯まる病気。炎症による腫瘍周囲組織の腫脹で第四脳室あたりが閉塞し、髄液の循環が阻害されたため?

*4:自己免疫性B細胞など(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27365313)

*5:所謂、がん免疫療法です。

*6:めちゃくちゃ詳しい。読むべし。

*7:免疫チェックポイント阻害剤使用時でも、"pseudoprogression"と言われて似たような現象が起きることが知られているらしい。

deepchemを動かしてみました?②

久しぶりの更新です。
deepchemのチュートリアルを動かそうとしたら、タンパク質の構造を表示してくれませんでした。ここで少しつまずいてしまったので、記事にまとめようと思います。deepchemと言うかdeepchem以前なのですが、、、。

はじめに

このチュートリアルをやろうと思いました。足りないパッケージは適宜追加しながらやれば問題ないだろうと思っていたのですが、途中、

ngltraj = visualize_complex(complex_mdtraj)
ngltraj

と言う部分で、

Failed to display Jupyter Widget of type NGLWidget.

みたいな文字が表示され、複合体の構造が表示されませんでした。「あれ?NGLviewは途中で入れたはずなのにな?」と思い色々調べたことをまとめます。

結論

NGLViewを入れる際に、!pipで適当に付け足すだけではダメだったのです。

!pip install ipywidgets
!jupyter nbextension enable --py widgetsnbextension --sys-prefix

!pip install nglview
!jupyter-nbextension enable nglview --py --sys-prefix

これをコピペしましょう。終わり。
試しに、

import nglview as nv
view=nv.demo()
view

としてタンパク質が出てくればオッケーです。クリクリして遊びましょう。f:id:fantom_zona:20181104043347p:plain

医薬品開発の流れについて

基礎研究によって発見された薬剤候補は、非臨床試験で有効性・安全性が確認された後に臨床試験に移る。臨床試験は1,2,3相に分かれ、人における有効性・安全性を試験する。臨床試験を経て、国による承認を得たものが新薬として発売される。発売後も医薬品が適正に使用されるように医薬情報は収集される(育薬研究)。

臨床試験

第Ⅰ相試験

原則として少人数の健康な成人を対象として、治験薬の安全性とADME(吸収、分布、代謝、排泄)を調べる。抗がん剤などでは患者を対象とし、予備的な有効性についても検証する。

第Ⅱ相試験

 比較的少人数の患者を対象として、いくつかの使用方法(投与量・投与間隔。投与期間)を検討し、使用方法を決定する。

第Ⅲ相試験

 多数の患者を対象として、既存薬やプラセボとの比較を行う。

育薬研究

5toos

・Too few
治験は1000程度の限られた患者数で得られた情報

・Too simple
年齢や併用薬、合併症に制限が加えられた患者群の成績

・Too brief
投与期間も長期でない

・Too median-age
高齢者や小児などへの適用例は少ない

・Too narrow
腎機能・肝機能障害を合併する患者や妊婦は除外され、評価は専門家によって行われる

骨リモデリング・骨代謝における力の役割について

骨は、周囲の力学的刺激に誘導されるリモデリングによって、構造を変化させ適応的に身体を支える構造を維持している。例えば、宇宙飛行士や寝たきりの患者では、骨への力学的負荷が掛からないため、骨量の減少が認められる。このように、力学的刺激は骨構造の維持に重要な因子であることが分かっている。

骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスによって制御されている。骨系細胞の一つである骨細胞は、骨への力学的負荷に応答しリモデリングを担う細胞群の活動を調節するメカノセンサーとしての役割を果たすと考えられている。骨細胞が力学的負荷を感知すると、NOやプロスタグランジンを産生することで、骨形成の方向に促進させることが知られている。骨細胞の力学刺激の形態としては、間質液流や静水圧上昇などが提案されているものの、未だそのメカニズムに関しては不明な点が多い。

 

**参考文献

CiNii Dissertations - 骨細胞の力学刺激感知およびカルシウム応答伝播のバイオメカニクス

Bone remodelling at a glance. - PubMed - NCBI

Tinderで遊ぶ

こんにちは。
色々辛いことがあって、むしゃくしゃしたのでTinderで色々遊んでみました。
とりあえず今回はTinderAPIを使って見ました。

Pynderの取得

pynderというものを使用しました。

git clone https://github.com/charliewolf/pynder
cd pynder 
python setup.py install

実は、pipでも入れることが可能なのですが、こちらのライブラリでは色々エラーが出てきてしまいます。どうやらgit cloneの方ではそれらのエラーは出てこないようなので、こちらで入れるようにしましょう。

トークンの取得

次に、facebookトークンを取得します。
https://tinderface.herokuapp.com/に取得方法が記載されているとの情報が多かったのですが、リンク先がメンテナンス中でした。
8月時点でもメンテナンス中との情報があったので、諦めて別の方法を模索しました。
まず、web版のTinderにログインし、左クリックで検証を選択。Networkのタブを選択し、Nameのやつを色々選択していくとX-Auth-Tokenというのがあります。これがトークンですが、2時間で変更されてしまうので注意しましょう。

やっとTinderで遊べる

import pynder
token="先ほどのトークン"
session=pynder.Session(XAuth_token=token)

helpでみてみるとこんな感じです。

"""
class Session(builtins.object)
 |  Methods defined here:
 |  
 |  __init__(self, facebook_token=None, XAuthToken=None, proxies=None, facebook_id=None)
 |      Initialize self.  See help(type(self)) for accurate signature.
 |  
 |  get_fb_friends(self)
 |      Returns array of all friends using Tinder Social.
 |      :return: Array of friends.
 |      :rtype: Friend[]
 |  
 |  matches(self, since=None)
 |  
 |  nearby_users(self, limit=10)
 |  
 |  profile = <cached_property.cached_property object>
 |  update_location(self, latitude, longitude)
 |  
 |  update_profile(self, profile)
 |  
 |  updates(self, since=None)
 |  
 |  ----------------------------------------------------------------------
 |  Data descriptors defined here:
 |  
 |  __dict__
 |      dictionary for instance variables (if defined)
 |  
 |  __weakref__
 |      list of weak references to the object (if defined)
 |  
 |  banned
 |  
 |  can_like_in
 |      Return the number of seconds before being allowed to issue likes
 |  
 |  likes_remaining
 |  
 |  super_likes_remaining
"""

get_fb_friendsというmethodは、facebook上の友達でtinderをしているユーザーを出すmethodのようですが何も出てきませんでした。(facebookではTinderを使用していることが秘匿される様配慮されているはずだが......。)1年ほど前まで使えていたようですが、APIの仕様が変更したらしく現在は使用できません(https://github.com/fbessez/Tinder)。少し残念な気持ちになりました。
nearby_usersは近隣のユーザーを出してくれます。defaultの数が10になっていますが、なぜか無限に出てきてしまいます。カウンタを付けて適度に出しましょう。そうしないと、429 Too Many Requestsとなってしまいます。リクエスト拒否のペナルティが12時間ほどあるので気をつけましょう。表示条件は、Session.profileのmethodから色々みることが可能です。

me=Session.profile
print(me.distance_filter) #指定距離
print(me.age_filter_min) #表示するユーザーの年齢下限
print(me.age_filter_max) #表示するユーザーの年齢上限

他にもsession.update_locationで自分の位置を自由に変更することが可能です。使い方としては特定の大学の位置を指定するとかですかね。丸の内OLや港区女子を狙ったりすることも出来るかもしれません。
短いですが、とりあえずPynderの使い方としてはこれくらいで。もし続編があるとしたら画像処理とテキスト解析でしょうかね。

アンブロキソールの効果

今回はこの論文

アンブロキソールと言えば痰切りとして誰もが知るところだが、具体的な機序についてはそういえばよく知らない。医学生程度ではこういう機序の分からないものは結構あり、実際教科書に載っているような生理学や分子生物学に基づかない機序であることが多いようだ。こういうのは幾らでもあり、アンブロキソールを始め、カルボシステインだとかマグミットだとかミヤBMだとかかなり頻繁に使用される薬剤にも存在すると思われる。だから、アンブロキソールなんてものがautophagy-lysosome系に作用するなんてのは僕にとってかなり驚きである。

Gaucher病の原因変異として知られていたGBA1変異が、GWASの結果から、実はParkinson病の相当なリスクファクターであることは界隈では有名だが、まさかアンブロキソールがGCaseのシャペロンだなんてことは全く知らなかった。論文の内容としては、アンブロキソールがautophagyを抑制しexocytosisを促進したり、ミトコンドリアの生合成を促進するという内容。α-synuclein代謝まで言及されており、リン酸化α-synucleinが減少することからParkinson病を抑制する方向に行くのではないかと示唆されている。(僕はそれは怪しいと思うが)

discussionで機序の仮説として書かれているのは、アンブロキソールがlysosomeに移行しexocytosisやCa2+放出を促進し、autophagyの抑制やTFEBの活性化が起きるということだそうだ。(仮説を示すデータはこの論文では示されていない。)ちなみに、実際にアンブロキソールを内服したら神経細胞に影響を与えるか?という考察もされており、内服だけではこの実験の濃度には達しないだろうと書かれている。

GBAやアンブロキソールの先行研究を知らないのでなんとも言えないとこだが、非常に面白い内容だと思った。アンブロキソールがいつ発売されたのか知らないが、おそらく新しい薬ではないだろうと思う。こういう昔ながらの薬の機序は意外と面白いような気がしていて、マクロライドの抗炎症作用だとかメトホルミンのGLP-1分泌促進作用だとか意外な関係が調べてて面白い。余談だが、この前薬屋さんの説明で聞いた話では、メトホルミンにGLP-1促進作用があるので、DPP4との組み合わせが非常に良いらしい。あと、ビグアナイドを内服してる際は休薬しないと造影剤を基本的には使ってはいけないが、実のところ、メトホルミンではそんなに乳酸アシドーシスが起きないのではないかとかなんとか。データがきちんとあるのかは知らないが。でも乳酸アシドーシス怖いもんね。